Desarrollo de un modelo experimental para la caracterización de la respuesta funcional del corioamnios humano

Objetivo: Este estudio fue diseñado para validar y caracterizar un modelo de cultivo de membranas corioamnióticas (MC) humanas que permita mantenerlas íntegras, viables y reproducir su capacidad de respuesta como tejido, que separa al compartimiento materno-fetal ante diversos estímulos asociados al proceso infeccioso. Material y métodos: Se utilizaron MC de mujeres con 37-40 semanas de gestación, sin trabajo de parto activo, ni señales clínicas y/o microbiológicas de infección cervicovaginal. Las MC fueron sujetadas a una placa de cultivo tipo transwell, que permitió la formación de dos compartimentos independientes delimitados por la membranas que se mantuvieron en cultivo 96 h, se evaluó la integridad estructural mediante resistencia eléctrica transepitelial y análisis histológico. La funcionalidad se midió estimulando de manera independiente o cunjunta amnios y/o corion con 500 ng/mL de lipopolisacárido o 5 ng/mL de IL-1β y cuantificando la secreción de TNFα por ELISA y de Metaloproteasa-9 (MMP-9) por zimografía, respectivamente. Resultados: Las diferentes poblaciones celulares de las MC se mantuvieron metabólicamente viables en el cultivo; los parámetros de integridad indicaron que no presentan cambios morfo-estructurales significativos. El estímulo con IL-1β induce secreción diferencial de MMP-9, que en corion alcanzó su máximo a la 4 h y en amnios a las 24 h. La estimulación selectiva con lipopolisacárido indujo la síntesis diferencial de TNFα, siendo el corion el principal productor con aproximadamente 60%. Conclusiones: El sistema de cultivo de MC propuesto, permite estudiar cuantitativa y cualitativamente la contribución de las distintas poblaciones celulares del corioamnios en la respuesta ante el estímulo diferencial con agentes inmunológico-infecciosos.

Objective: This study was designed to validate and characterize a culture model of human choriamniotic membranes (HCM) that keeps their viability, integrity and capacity to reproduce a response to several stimulus associated to an infectious process, as the tissue that separates the fetal and maternal compartment. Material and methods: We use HCM obtained after delivery by elective cesarean section. Women with 37-40 weeks of gestation without evidence of active labor or presence of clinical an microbiological signs of intrauterine/vaginal infection. The membranes were mounted in transwell devices, allowing testing two independent compartments (chorion and amnion) by physically separating the upper and lower chambers. 500 ng/mL of lipopolysaccharide was added to amniotic or chorionic surface and secretions of TNFα was measured in both compartments by specific enzyme-linked immunosorbent assays and Metalloproteinase-9 (MMP-9) secretions after stimulation with 5 ng/mL of IL-1β. Results: The viability test showed that the different cellular populations of the HCM keep their metabolic viability along 96 h of culture. The integrity parameters showed that the stay without morphologic and structural changes. Functional markers showed that membranes responded differentially to IL-1β stimulus; production of MMP-9 in chorion reached its maximum value at 4 h, while amnion reached it at 24 h. The selective stimulation of chorioamnion with lipopolysaccharide induced a differential synthesis of TNFα; the chorion was the principal producer with approximately 60% of total TNFα. Conclusions: The experimental model allows to study qualitatively and quantitatively the contribution of different cellular regions of the HCM, and its response to differential stimulation with immunologic agents.

Mechanism of ammonium translocation in rat liver mitochondria: finger-printing of the translocator

Nosotros hemos estudiado si el amoníaco atraviesa la membrana interna de la mitocondria de hígado de rata como una especie cargada (NH+4) o descargada (NH3). El hinchamiento pasivo de mitocondrias suspendidas en acetato de amonio y/o sodio, mostró que: el hinchamiento depende de la concentración de amonio de la misma forma en que depende de la de sodio (a concentración de acetato constante). Las curvas alcanzan una meseta a 115 mM de amonio y 100 mM de sodio. Un cambio de dos unidades de pH induce un cambio de dos órdenes de magnitud en la concentración de NH3, en tanto que la de NH+4 permanece casi constante. Sin embargo, la magnitud y la velocidad iniciales de hinchamiento no cambian significativamente. Los resultados se discuten en términos que el NH+4 es translocado como una especie cargada vía un sistema de transporte. El sistema de transporte se caracterizó estudiando el hinchamiento de mitocondrias de hígado de rata suspendidas en acetatos de cationes alcalinos, de amonio y de cationes nitrogenados: el patrón de selectividad del translocador es NH+4>Na+>Li+>K+>Rb+>Cs+> (Secuencia X de Eisenman). Para cationes nitrogenados homólogos la permeabilidad disminuye a medida que el peso molecular aumenta o la movilidad en solución disminuye. Los iones con un radio de Ladd menor que 3.7-3.8 A y área por debajo de 15 A2 son permeables, los que tienen un mayor radio o área no lo son. Cuando la cadena de los cationes nitrogenados monosustituidos se alarga, la permeabilidad decrece, pasa por un mínimo cuando el nC = 4 y luego aumenta. Los cationes nitrogenados que no forman puentes de hidrógeno no entran a la mitocondria; los que tienen uno, dos o tres protones para donar tienen permeabilidades semejantes, y aquellos con uno, dos o tres oxígenos aceptores de protones aumentan su permeabilidad casi linealmente. La formamidina, acetamidina, TEA, derivados de la guanidina, N,N-diciclohexilcarbodiimida y N-etil maleimida no fueron capaces de inhibir el hinchamiento pasivo inducido por sodio en la mitocondria

Magnesium and octylguanidinium inhibition of monovalent cation translocation in mitochondria

Nosotros hemos estudiado los efectos inhibitorios de varios cationes (OG+, Mg2+, Ca2+, Ba2+, Mn2+, La3+) sobre las vías"uniport" y de intercambio para el Na+ y el K+ en mitocondrias de hígado de rata. El hinchamiento de las mitocondrias suspendidas en acetato de sodio o de potasio indica que: 1. El influjo pasivo de Na+ a mitocondrias inhibidas no se ve afectado por OG+ (en el rango micromolar), y concentraciones milimolares de cationes polivalentes sólo inducen una inhibición pobre, siendo la secuencia La3+>Mn2+>Ca2+>Mg2+>Sr2+ = 0. 2. El influjo activo de sodio se inhibe en un 50% con Mg2+ 60 micronM o con OG+ 90 micronM. El La3+, Mn2+, Ca2+ y Sr2+ también inhiben el influjo de sodio (rango milimolar). Se necesitan 10 mM de Mg2+ o 35 micronM de OG+ para inhibir en un 50% el influjo activo de potasio. 3. La salida de cationes alcalinos de mitocondrias parcialmente hinchadas e inhibidas se bloquea en un 50% con 2 mM de Mg2+ o 105 micronM OG+ siempre que el sodio sea el principal catión permeable de la solución. Se necesitan 3 mM de Mg2+ o 38 micronM de OG+ para inhibir en un 50% a las mitocondrias suspendidas en acetato de potasio. 4. La salida de cationes alcalinos de mitocondrias activas parcialmente hinchadas suspendidas en acetato de sodio se ve favorecida por concentraciones superiores a 0.1-0.2 Mg2+ o 50-100 micronM OG+. Estos datos se ajustan a un mecanismo que involucra a un translocador que introduce Na+ en un proceso dependiente de energía y que es sensible a Mg2+ y OG+ y un intercambiador catión/H+, insensible a Mg2+ y OG+, que trabajan en balance dinámico